klevoz.ru страница 1страница 2страница 3страница 4
скачать файл


МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ ТА ПРДОВОЛЬСТВА УКРАЇНИ

СУМСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
Біотехнологія в рослинництві
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

щодо виконання лабораторних робіт

Суми – 2012

МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ ТА ПРДОВОЛЬСТВА УКРАЇНИ

СУМСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Кафедра біотехнології та фітофармакології
Біотехнологія в рослинництві
МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

щодо виконання лабораторних робіт,

для студентів 5 курсу спеціальності: 7.09010501 «Захист рослин» денної форми навчання

Суми – 2012

УДК 631.1



Укладач: Варавкін В.О., доцент, кандидат біологічних наук
Біотехнологія в рослинництві. Методичні вказівки, щодо виконання лабораторних робіт для студентів 5 курсу спеціальності 7.09010501 «Захист рослин», денної форми навчання . – Суми: СНАУ, 2012. – 58 с., табл.9, рис.5, бібліограф. 15.

В методичних вказівках розроблені практичні завдання, виконання яких забезпечить закріплення теоретичних знань з дисципліни «Біотехнологія в рослинництві»




Рецензенти: Бердін С.І. , доцент кафедри селекції і насінництва ім. М.Д. Гончарова, кандидат с.-г. наук

Тихонова О.М., доцент кафедри ботаніки і фізіології рослин, кандидат біологічних наук




Відповідальний за випуск Подгаєцький А.А., професор, доктор с.-г. наук, завідувач кафедри біотехнології та фітофармакології

Рекомендовано до видання вченою радою навчально-наукового Інженерно-технологічного інституту СНАУ. Протокол № від « » 2012р.



© Сумський національний аграрний університет, 2012

Зміст

ТЕМАТИЧНИЙ ПЛАН ДО ВИКОНАННЯ ЛАБОРАТОРНИХ РОБІТ………….4

ПЕРЕДМОВА………………………………………………………………………..5

тема 1. Біотехнологія та її методи дослідження. техніка культивування ізольованих клітин тканин рослин на штучних живильних середовищах в умовах in vitro...........................................................................................................................7

Робота 1. Ознайомлення з правилами та технікою безпеки в лабораторії .. 7

Робота 2. Ознайомлення з мікроскопічною технікою……………………….11

Робота 3. Ознайомлення із стерилізацією при проведенні робіт з культурою ізольованих клітин і тканин: стерилізація посуду, живильного середовища, рослинного матеріалу………………………………………...16

Робота 4. Приготування поживного середовища……………………………23

Робота 5. Вирощування стерильних паростків томатів і баклажанів………29

тема 2. особливості культивування кулюсних культур…….30

Робота 1. Одержання і культивування калюсної тканини із сої…………30

Робота 2. Одержання і культивування калюсу із стерильних проростків картоплі………………………………………………………………………33

тема 3. клональне мікророзмноження рослин…………………...34

Робота 1. Вивчення техніки вирощування безвірусного матеріалу……...34

Робота 2. Виділення апікальної меристеми суниці і культивування її. Клональне мікро розмноження суниці……………………………………..37

Робота 3. Виділення меристеми картоплі і використання живильних середовищ для культивування її……………………………………………39

Робота 4. Розмноження пробіркових рослин картоплі……………………42

Робота 5. Отримання мікро бульб картоплі та укорінення полуниці .…..46

Робота 6. Ознайомлення з мікро клональним розмноженням цукрових буряків………………………………………………………………………..49

тема 4. генетична інженерія………………………………......................51

Робота 1. Використання генетичної інженерії на рівні хромосом……….51

Тематичний план до виконання лабораторних робіт




Тема

Назва лабораторних робіт


Кількість

годин


тема 1. Біотехнологія та її методи доослідження. техніка культивування ізольованих клітин тканин рослин на штучних живильних середовищах в умовах in vitro.

Робота 1. Ознайомлення з правилами та технікою безпеки в лабораторії.

2

Робота 2. Ознайомлення з мікроскопічною технікою.

2

Робота 3. Ознайомлення із стерилізацією при проведенні робіт з культурою ізольованих клітин і тканин: стерилізація посуду, живильного середовища, рослинного матеріалу.

2

Робота 4. Приготування поживного середовища.

2

Робота 5. Вирощування стерильних паростків томатів і баклажанів.

2

тема 2. особливості культивування кулюсних культур.

Робота 1. Одержання і культивування калюсної тканини із сої.

2

Робота 2. Одержання і культивування калюсу із стерильних проростків картоплі.

2

тема 3. клональне мікророзмноження рослин.

Робота 1. Вивчення техніки вирощування безвірусного матеріалу.

2

Робота 2. Виділення апікальної меристеми суниці і культивування її. Клональне мікро розмноження суниці.

2

Робота 3. Виділення меристеми картоплі і використання живильних середовищ для культивування її.

2

Робота 4. Розмноження пробіркових рослин картоплі.

2

Робота 5. Отримання мікро бульб картоплі та укорінення полуниці.

2

Робота 6. Ознайомлення з мікро клональним розмноженням цукрових буряків.

2

тема 4. генетична інженерія.

Робота 1. Використання генетичної інженерії на рівні хромосом.

2


ПЕРЕДМОВА
Біотехнологія – напрямок прикладної біології, що базуються на використанні біосинтетичного потенціалу мікроорганізмів, рослинних і тваринних клітин, що культивують на штучних поживних середовищах in vitro; ізольованих протопластів, окремих клітинних органоїдів і біологічно активних молекул.

Біотехнологія має тісний зв’язок з генетикою і селекцією рослин. Її методи мають значення при поліпшенні існуючих та створенні нових високопродуктивних, стій­ких до біотичних та абіотичних факторів, сортів рослин, корисних штамів мікроорганізмів. Важливу роль у вирішенні цих питань займають біотехнологічні методи, які сприяють перетворенню сільсь­кого господарства у високоефективну, конкурентноздатну, екологічно безпечну галузь.

Біотехнологія включає галузі: 1 – промислову мікробіологію і мікробіологічний синтез; 2 – молекулярну біологію, генну інженерію клітинну технологію, клітинну інженерію. Сучасна біотехнологія розпочалась з успіхів у технічній мікробіології, а пізніше у молекулярній генетиці, є як галуззю виробництва господарсько - цінних продуктів, заснованого на використанні біологічних об’єктів, процесів і систем. Біотехнологія тісно пов’язана з фізіологію рослин, мікробіологією, генетикою, біохімією та ін.

Важливими розділами біотехнології для рослинництва є мікроклональне розмноження рослин, генетична (генна) і клітинна інженерія. Генну інженерію визначають як сукупність методів маніпулювання генетичним матеріалом переносу за допомогою перенесення або дією на гени, які визначають ту чи іншу генетичну ознаку з метою одержання гібридних (рекомбінантних) ДНК. За допомогою клітинної інженерії здійснюють маніпуляції на клітинному рівні – на рівні окремих клітин або їх сукупності. Мікроклональне розмноження дає можливість отримати за короткій час рослинного матеріалу(рослин регенерантів).



Сільськогосподарська біотехнологія – це сукупність технічних прийомів для генетичної модифікації культурних рослин та тварин, вирішення специфічних завдань селекції, створення та розмноження рослинних і тваринних організмів з метою одержання з них різноманітних корисних речовин.

Досягнення сільськогосподарської біотехнології дозволяють:

• проводити клональне розмноження рослин і тварин;

• оздоровлювати посадковий матеріал;

• створювати цінні дигаплоїдні форми для селекції рослин;

• одержувати транс генні рослини, тварини і мікроорганізми з корисними ознаками;

• створювати нові штами цінних мікроорганізмів, у тому числі з підвищеною азот фіксуючою здатністю;

• створювати ефективні біологічні засоби захисту рослин;

• одержувати в промислових масштабах методом мікробіологічного синтезу цінні речовини і продукти: ферменти, гормони, амінокислоти, вітаміни, кормовий білок та ін.

• здійснювати у тваринництві трансплантацію ранніх ембріонів і запліднення in vitro;

• створювати банк генів корисних організмів.

Для розвитку сільськогосподарської біотехнології є необхідність підготовки кваліфікованих кадрів, які здатні успішно та професійно працювати на різних напрямках, що пов’язані з біотехнологією в аграрному секторі. З метою досягнення результатів цього напрямку, е необхідність проходження курсу лабораторно - практичних занять. Студенти повинні навчитися культивувати тканини і клітини вищих рослин на штучних поживних середовищах in vitro, навчитися одержувати рослини регенеранти, проводити клональне мікророзмноженя і оздоровлення рослин, а також ознайомитись з клітинними технологіями in vitro, які полегшують і прискорюють традиційний селекційний процес.




TEMA 1. Біотехнологія та її методи дослідження. техніка культивування ізольованих клітин тканин рослин на штучних живильних середовищах в умовах in vitro

Робота 1. Ознайомлення з правилами та технікою безпеки в лабораторії

Правила роботи з хімічними реактивами

1. Всі хімічні реактиви повинні зберігатися у спеціальній тарі, мати ярлики з чітким позначенням вмісту.

2. Забороняється зберігати у лабораторії хімічні сполуки невідомого походження, а також використовувати реактиви невідомого походження.

3. Скляні ємності з концентрованими розчинами повинні бути сухими і


чистими ззовні і вміщені у корзини, які мають прокладки з тирси, змоченої негорючими матеріалами.

4. Під час роботи з кислотами і лугами, потрібно:

а) розливаючи кислоти, використовувати скляні трубопроводи із
сифонами;

б) переливання "димлячих" кислот проводити тільки у витяжних шафах;

в) готуючи розчини кислот, кислоту вливати у воду при охолодженні, а не навпаки, тому що під час взаємодії кислоти з водою відбувається виділення великої кількості тепла, внаслідок чого суміш може розбризкуватися;

г) розчинення лугів проводити у глибоких фарфорових чашках з


постійним перемішуванням і охолодженням у витяжній шафі;

д) всі роботи з великими об'ємами концентрованих розчинів лугів і


кислот проводити тільки в гумових рукавичках, захисних окулярах, халатах;

е) розливати концентрований розчин аміаку тільки у протигазах;

є) якщо кислота або луг попали на стіл чи підлогу, розчин спочатку змити великою кількістю води, а потім нейтралізувати і знову промити

5. Аптечка повинна містити: розчин йоду (5%), вату, валеріанові краплі,


насичений розчин КМпО4, спирт, розчин NaНСО3 (2%), розчин бури (2%), розчин оцтової кислоти (5%), розчин NaОН (3%).

Основні правила роботи з електроприладами

1 . Електронагрівальні прилади (до 800 Вт) вмикаються у звичайні розетки.



  1. Електронагрівальні прилади (більше 800 Вт) під'єднуються до щитів і
    повинні мати контрольну лампочку.

  2. Усі нагрівальні прилади повинні мати постійне місце, теплоізоляцію знизу
    і біля стін (кераміка). Над розетками повинні бути етикетки; які вказують
    напругу.

З а б о ро н я є т ь с я:

а) працювати з електроприладами, які пошкоджені;

б) вмикати прилади біля летких речовин чи легкозаймистих рідин;

в) залишати електроприлади без нагляду;

г) працювати з електроприладами без заземлення;

д) користуватися "жучками".



  1. Причинами пожеж є замикання, струмові перевантаження
    електрообладнання. Для попередження замикання потрібно передбачити
    електрозахист електроприладів: використання повітряних автоматичних
    вмикачів (автомати).

  2. При експлуатації електропровідників не можна включати додаткові
    електроприлади, якщо провідники на це не розраховані. Не можна
    допускати перегрівання електроприладів.

Дії при виникненні пожежі

1. Діяти треба швидко, поки полум'я ще не охопило велику площу. Вимкнути електрику. Користуючись вогнегасником, необхідно скерувати отвір на предмет, що горить, а не на полум'я. Оповістити пожежну охорону, вказавши адресу. Із задимленого приміщення вибиратися треба, захистивши ніс і рот вологою тканиною. Не розкривати вікон і дверей. Не вистрибувати з вікон, якщо це, не є єдиним шляхом до спасіння. Життя важливіше за обладнання.

2. Якщо одяг спалахнув, його треба скинути, або накрити місце, яке загорілося, тканинок (протипожежною ковдрою). Якщо тканина відсутня, треба впасти на землю і сильно притиснути частину, що спалахнула.

Типи вогнегасників та їх використання


  1. Вуглекислотні вогнегасники ОУ-2, ОУ-5, ОУ-3 приводяться в дію
    поверненням маховичка вентиля до упору. Час роботи - 25-40 с.

  2. Вуглекислотно-брометилові вогнегасники ОУБ-3, ОУБ-7 можна
    використовувати для боротьби з пожежами електроприладів під
    напругою.

  3. Хімічні вогнегасники ОХП-10 (ОП-5) використовують, якщо загорілись
    тверді речовини і горючі рідини, їх не можна використовувати біля
    електроприладів! Час дії - 60 с.

Перша допомога потерпілим у разі виникнення небезпечних ситуацій

Ушкодження електрострумом

  1. Вимкнути струм.

  2. Якщо струм не можна вимкнути, прибрати електропровід сухою палкою
    або руками в гумових рукавичках. При цьому краще працювати однією
    рукою.

  3. Викликати швидку медичну допомогу.

  4. До появи медичного працівника:

а) якщо людина втратила свідомість, але дихає, її потрібно покласти і, розстебнувши Одяг, збільшити доступ свіжого повітря; дати понюхати вату з нашатирем, розтерти і обігріти тіло;

б): якщо ознаки життя відсутні, потрібно робити штучне дихання і


масаж серця. .

При попаданні на шкіру:

видалити краплі рідини ватою, промити уражене місце великою кількістю води, а потім нейтралізувати: ; луг- 2%-м розчином СНзСООН.

При опіках очей:



  1. Промити очі великою кількістю води.

  2. Обов'язково звернутися за медичною допомогою.

При пораненнях

  1. Якщо рана невелика, то спочатку промити розчином КМпО4 (2%), а
    потім змазати розчином йоду і накласти пов'язку.

  2. Якщо є велика кровотеча, то потрібно накласти джгут і звернутися в
    лікарню (джгут повинен бути накладений не більше як 1,5 год.).

При отруєннях

1 Отруєну людину винести на свіже повітря. Розстебнути одяг, але не


переохолодити хворого.

  1. Якщо дихання відсутнє - робити штучне дихання.

  2. Якщо отрута попала в органи травлення - викликати блювоту, Дати проти отруйні засоби.


Робота 2. Ознайомлення з мікроскопічною технікою
Матеріали і устаткування: спирт, оцтова кислота, кармін, осеїн, мікроскоп, скло предметне та покривне.
Пояснення. У цей час мікроскопи використаються для візуальних спостережень, фотографування, точних кількісних вимірів. Хоча різні марки світлових мікроскопів мають конструктивні відмінності, у кожному з них існують оптичні й механічні вузли. Принципова схема мікроскопа й освітлювальної системи наведена на рисунку 1.

Освітлювальна система (конденсор і дзеркало), об'єктиви й окуляри разом з тубусом становлять оптичний вузол, у якому всі складові частини центровані по відношенню друг до друга.



Конденсор розташований під столиком мікроскопа й складається із двох або трьох лінз. Розрізняють кілька типів конденсорів залежно від методу спостереження в мікроскопі: конденсор світлого поля, конденсор темного поля, конденсор для спостереження по методу фазового контрасту, конденсор з апертурною діафрагмою для косого висвітлення й ін. Мікроскопи МБР-3 і МБИ-3 постачені апланатичним конденсором ОИ-14 для прямого й косого висвітлення.




Рис. I. Принципова схема

мікроскопа й освітлювальної

системи (по Г. Е. Скворцову

1969):


1 — джерело світла; 2 -колектор; 3 — польова діафрагма освітлювача: 4 — дзеркало; 5-апертурна діафрагма конденсора: 6 — конденсор; 7 — препарат; 8 — об’ектнв; 9 - вихідна зіниця об'єктива; 10 - польова діафрагма окуляра: 11-окуляр; 12-око.



Дзеркало мікроскопа має дві поверхні (плоску й увігнуту); воно розташовується під конденсором, направляючи в нього світло. З конденсора пучок світла попадає на препарат, що перебуває на столику мікроскопа, а потім входить в об'єктив.

Отже, дзеркало й конденсор призначені для висвітлення препарату пучком світла.



Об'єктиви - найбільш важлива складова частина оптичного вузла мікроскопа. Сучасні об'єктиви - це багатолінзові системи, від якості яких й основному залежить зображення об'єкта. Недоліки (аберації) лінз можуть привести до того, що зображення в якомусь ступені виявиться пофарбованим або розмазаним, скривленим.

Залежно від того, у якому ступені виправлені аберації, розрізняють наступні об'єктиви: ахромати, апохромати, планахромати й планапохромати. В об'єктивів - ахроматів виправлені сферична аберація, кома й хроматизм положення для двох довжин хвиль. Це найбільш прості системи, типові для робочих мікроскопів (МБР-1, МБР-3, «Біолам 70»). Більше складною системою, у якої виправлені сферична аберація, кома, астигматизм, хроматизм положення для трьох довжин хвиль, що забезпечує більше високу якість зображення, є об'єктиви-апохромати. Вони входять у комплект дослідницьких мікроскопів МБИ-3, МББ-1, МБИ-11. МБИ-15.

В об'єктивів-ахроматів й апохроматів не усунута повністю кривизна зображення, при якій зображення виявляється розмитим на краях поля зорі, що особливо незручно при мікрофотозйомці. Для усунення цього недоліку створені об'єктиви із плоским полем зору - планахромати й планапохромати.

На оправі імерсійних об'єктивів є канавки різних кольорів залежно від виду імерсії: чорна на об'єктиві масляної імерсії (крім того, є оцінка МІ на оправі), біла на об'єктиві водної імерсії (оцінка ВІ на оправі) і жовта на об'єктиві гліцеринової імерсії.

Призначення об'єктива можна сформулювати так: об'єктив будує геометрично подібне до об'єкта збільшене зображення зі зворотним розташуванням частин, стосовно препарату й у той же час виявляє подробиці, недоступні ока людини.

Крім роздільної здатності, об'єктив характеризується певною фокусною відстанню й збільшенням. Слабкі об'єктиви мають велику фокусну відстань - 50-60 мм, а сильні 1-3 мм, тобто чим більше фокусна відстань, тим менше збільшення об'єктива.

Збільшення об'єктива зазначене на оправі. У мікроскопа МБР-1 об'єктиви мають збільшення 9Х, 40Х, 90Х і апертуру, відповідно 0,20; 0,65 й 1,25.

Кожен об'єктив характеризується певною величиною робочої відстані в міліметрах. Об'єктиви з малим збільшенням мають відстань від об'єктива до препарату в багато разів більше, ніж об'єктиви з більшим збільшенням. Залежно від цього під час роботи доводиться дуже строго стежити за тим, якою рукояткою потрібно користуватися при фокусуванні мікроскопа, щоб не роздавити препарат і не зіпсувати об'єктив. Так, об'єктиви мікроскопа МБР-3 зі збільшеннями 9Х. 40Х и 90Х мають робочі відстані відповідно 13,8; 0,6 й 0,12 мм. Об'єктив малого збільшення відрізняється не тільки максимальною робочою відстанню, але й більшим полем зору, тому дослідження препарату завжди починають із невеликого збільшення.

При роботі з мікроскопом важливе значення має товщина покривного й предметного стекол: навіть невелике відхилення від нормальної товщини (0,17 мм для покривного й 1,2 мм для предметного) позначається на якості зображення об’єктів.

Кожен об'єктив застосовується в конкретних умовах, для яких він призначений.



Окуляр улаштований значно простіше об'єктива. Нерідко він складається всього із двох лінз. По призначенню його можна зрівняти з лупою: він будує хібне зображення й збільшує його, не виявляючи подробиць будови.

Таким чином, завдяки об'єктиву й окуляру зображення мікроскопа виявляється уявним, двічі збільшеним і зворотним стосовно препарату.

Об'єктив й окуляр мікроскопа кріпляться на тубусі більшості випадків похилому. Нормальна довжина тубуса становить 160 мм. Для мікрофотографії похилий тубус заміняється вертикальним.

Механічний вузол мікроскопа складається зі штатива, на якому кріпляться оптичні деталі, предметного столика і механізмів для фіксування мікроскопа.

Для всебічного вивчення об'єкта й залежно від методу спостереження дослідник не обмежується біологічними мікроскопами (МБ), а застосовує стереоскопічні (МБС, МССО), поляризаційні (МП), люмінесцентні (МЛ, ЛЮ-МАМ), ультрафіолетові (МУФ), інфрачервоні (МИК), електронні (ЕМ) і інші мікроскопи. При передачі зображення на відстань користуються телевізійним мікроскопом, у якого оптичне зображення перетворюються в серію електронних сигналів. Для навчальних цілей і для повсякденної роботи в лабораторіях використають моделі робочих біологічних мікроскопів МБР- 3. Мікроскоп МБР-3 являє собою більшу модель робочого (рис. 2)

Рис. 2. Мікроскоп МБР-3:



1-підстава штатива: 2 – тубусотримач: 3 - бінокулярний тубус: 4 - окуляр: 5 - револьвер; 6- об'єктив; 7 - предметний столик: 8 - препаратовказчик: 9 - конденсор: 10 - дзеркало: 11 - рукоятка грубого фіксування; 13 - ручка точного фіксування.
біологічного мікроскопа, що дозволяє вивчати прозорі об'єкти й минаюче світло при прямому й косому висвітленні й у поляризованому світлі. Об'єктиви мікроскопа: I) планахроматичний зі збільшенням 9Х, апертурою 0,20; 2) ахроматичний зі збільшенням 40Х, апертурою 0,65; 3) ахроматичний масляної імерсії зі збільшенням 90Х, апертурою 1,25. Ця модель має зручний препаратовказчик, бінокулярний тубус зі збільшенням 1.5Х, що дозволяє встановлювати окуляри відповідно відстані між очами, і монокулярний тубус для фотографії.

Ще більші можливості для роботи має новий універсальний дослідницький біологічний мікроскоп МБИ-15, має ртутно-кварцову лампу, щоб проводити спостереження люмінесцентним методом, і автоматичним експонометром для мікрофотографії.

Крім мікроскопів, розглянутих вище, для вивчення біологічних об'єктів випускають мікроскопи спеціального призначення: поляризаційні, люмінесцентні, ультрафіолетові, інтерференційні, електронні й ін.

Хід роботи


  1. Ознайомитись з основними складовими та порядком роботи з мікроскопом.

2. Визначить загальне збільшення мікроскопа, яке знаходять як добуток збільшення об'єктива (Vоб.) на збільшення окуляра (Vок): V=Vоб × Vок.

3. Знайти корисне збільшення, яке визначається так: V корисне = (500:1000) А.

4. Розглянути постійні цитологічні препарати під мікроскопом.

Робота 3. Методи стерилізації під час проведення робіт з
культурою ізольованих клітин і тканин рослин


Матеріали і устаткування: чашки Петрі (3 шт., одна з фільтрувальним папером), стакани хімічні на 300-500 мл (4 шт.), колба на 1 л з дистильованою водою, пробірки з поживним середовищем М-С без гормонів і з гормонами (2,4 Д - 2,0 мг/л, кінетин - 0,2 мг/л), скальпелі, пінцети, голки, марлеві мішечки (4 шт.), 1%-й розчин бікарбонату натрію, крафт-папір, шпагат, ножиці, папір фільтрувальний або інший для матрациків, пральний порошок, хромпік, автоклав, сушильні шафи, фарфорові стакани (2 шт.), спиртівка, целофан, сірники.

Пояснення. Всі досліди необхідно проводити у стерильних примі­щеннях - боксу і ламінар-боксах. Стерилізують бокс, інструменти, посуд, рослинний матеріал, поживні середовища, ватні корки та всі інші матеріали, необхідні для роботи (додаток 1).

Стерилізація посуду. Весь посуд, що використовується для приготування, зберігання поживних середовищ і вирощування рослинного матеріалу, піддається старанному миттю.

Найбільш поширеним і надійним методом очистки і обеззараження скляного посуду є обробка його концентрованою сірчаною кислотою з біхроматом калію на протязі 4-6 годин з наступним промиванням теплою проточною водою впродовж 5 хвилин та двохразовим обполіскуванням дистильованою водою і один раз - бідистилятом.

Можна застосовувати і таку схему миття: попереднє замочування у розчині 0,3% перекису водню, потім миття розчином прального порошку з наступним обполіскуванням проточною водою, дистилятом і бідистилятом, як вказувалось вище. Після висихання посуд прожарюють в сухожаровій шафі за темпе­ратури + 160°С протягом 2 год. (з моменту встановлення потрібної температури). При такому нагріванні гинуть не тільки бактерії, але й їх спори.

Температура вище 175 °С недопустима, оскільки при цьому ватні корки буріють, а паперова обгортка стає ламкою.

Ще більш строгої стерилізації можна добитися під тиском в автоклаві, оскільки вологий жар більш пагубний для мікроорганізмів і спор. Посуд (стакани з кришками, чашки Петрі, піпетки) загортають у фольгу або обгортковий папір, зверху в целофан. При автоклавуванні градуйованих піпеток верхню частину їх загортають ватою і кожну загортають у папір окремо. Автоклавують під тиском 2 атм. протягом 25-30 хв.



Стерилізація ламінар-боксу. Ламінар-бокси призначені для культури ізольованих клітин, тканин і деяких інших робіт, які вимагають стерильності. Стерильність забезпечується з допомогою бактеріальних фільтрів, встановлених у ламіиар-боксі, через які нагнітається повітря. За 2 год. до початку роботи ламінар-бокс опромінюють (насвічують) бактерицидними ультрафіолетовими лампами. Попередньо до цього в ламінарі розміщують спиртівку, сірники, фарфоровий стакан з 96%-м спиртом і стакан із стерильною водою. Розміщують також стерильний посуд та інструменти, необхідні для роботи. При вичлененні апікальної меристеми (картоплі, великоплідної суниці) у ламінарі розміщують бінокулярну лупу. Перед початком роботи необхідно ретельно вимити руки з милом і протерти їх спиртом, одягти стерильний халат, зав'язати волосся стерильною марлевою косинкою або одягти стерильну шапочку. Розпочинати роботу слід з ретельного протирання внутрішньої поверхні ламінару, спиртівки, пробірок з поживним середовищем 70% спиртом.

Основною умовою успішного культивуваня ізольованих культур є стерильність поживного середовища, посуду, матеріалів, інструментів, посадкового матеріалу, приміщення для ізоляції і пересадки. Як показала практика, неохайність при проведенні експериментів в культурі іп vitro, навіть при хорошому забезпеченні робочого місця, зводить до нуля всі зусилля. Саме тому чистота значно важливіша, ніж унікальне спеціальне обладнання.

В зв'язку з цим роботи з мікроклонування проводять в асептичних умовах - в операційних кімнатах чи ламінар-боксах.

На першому етапі операційну кімнату очищають від бруду і пилу миттям водою з будь-яким миючим засобом. На другому етапі проводять її стерилізацію ультрафіолетовим опромінюванням на протязі 1,5-2 годин.

Стерилізацію рук проводять за допомогою 96°-ного етилового спирту.

В ламінар-боксі перед роботою інструменти ще раз стерилізують, опускаючи в стакан з 96° етиловим спиртом і обпалюючи кожен із них у полум'ї спиртівки. Після цього їх кладуть на стерильну чашку Петрі і використовують тільки для однієї маніпуляції перед повторним використанням інструментів стерилізацію в полум'ї спиртівки повторюють.

Перед відкриванням колби чи пробірки з поживним середовищем їх обтирають ватою, змоченою в спирті, горловину обпалюють над полум'ям спиртівки.

Проводячи посадку експлантів, колбу треба тримати під кутом поблизу полум'я спиртівки. Після посадки ковпачок із фольги обпалюють і швидко закривають ним колбу чи пробірку.

Розрізання рослин зручно проводити на стерильних салфетках із фільтрувального паперу.

скачать файл


следующая страница >>
Смотрите также:
Методичні вказівки щодо виконання лабораторних робіт
795.65kb.
Методичні вказівки та завдання для виконання лабораторних робіт з дисципліни
875.77kb.
Методичні вказівки до виконання магістерських робіт
653.37kb.
Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з курсу програмне забезпечення комп’ютерних систем для студентів спеціальності 091501
115.41kb.
Методичні вказівки до лабораторних робіт з колоїдної хімії (для студентів 3 курсу денної форми навчання спеціальності 092601 „Водопостачання та водовідведення ) /Укл. Панайотова Т. Д., Зайцева І. С., Ігнатов І.І
356.64kb.
Контрольна робота з навчальної дисципліни організація роботи з кадрами виконав: прізвище, ім’я, по батькові (повністю)
223.84kb.
Методичні рекомендації до виконання контрольної роботи
679.81kb.
Фізика як природнича наука
278.03kb.
Комплект контрольних робіт призначено для проведення комплексних контрольних робіт серед учнів ІІІ курсу бпал (усіх професій) у письмовій формі. На виконання контрольних робіт передбачено 45 хвилин
88.84kb.
Методичні вказівки до розв’язання задач по темі «Кінематика, поступальний рух»
439.41kb.
Методичні вказівки до розрахунково графічної роботи «головний електропривод стругального верстата»
326.68kb.
Методичні вказівки до виконання курсової роботи з дисципліни «Дослідження операцій»
1944.19kb.